Vitrificación de ovocitos equinos: efecto del estado de maduración sobre el desarrollo embrionario

Abstract

La vitrificación en gametas femeninas equinas, podría ser importante como complemento a otras técnicas de reproducción asistida, siendo especialmente beneficiosa en una especie con estacionalidad marcada como es el caso de los equinos. El mayor potencial de utilización de esta técnica sería alargar los periodos de tiempo que transcurren entre la recuperación de los ovocitos y la fecundación in vitro, permitiendo además, retrasar la decisión de qué padrillo se utilizará, o bien como estrategia para mitigar la senescencia ovárica y preservar la calidad de los ovocitos. Sin embargo, los resultados obtenidos hasta el momento, no han permitido expresar el potencial de la técnica, habiendo demostrado un alto nivel de toxicidad, y necesidad de un mayor estudio en los métodos de vitrificación y calentamiento para aumentar la eficiencia en la supervivencia de los ovocitos. El objetivo del presente trabajo fue determinar el potencial de los ovocitos vitrificados en estadio inmaduro para alcanzar la maduración nuclear, analizar el porcentaje de ovocitos lisados para determinar la viabilidad, y estudiar el desarrollo in vitro de ovocitos vitrificados en distintos estadios de maduración. El estudio fue desarrollado en el Laboratorio de Biotecnología y Reproducción Animal; los complejos cumulus-ovocito (COCs) fueron obtenidos a partir de ovarios post-mortem utilizando la técnica de slicing y raspaje folicular. Aquellos ovocitos seleccionados para ser vitrificados inmaduros, fueron introducidos en diferentes concentraciones de crioprotectores (CPA) y luego cargados en el dispositivo de vitrificación Cryotop® para ser sumergidos en termos de nitrógeno liquido. En el momento de utilización de los ovocitos, se procedió con el calentamiento y fueron sumergidos en concentraciones decrecientes de trehalosa para evitar un shock osmótico y diluir los crioprotectores. Posteriormente, tanto aquellos ovocitos criopreservados inmaduros como los seleccionados para ser vitrificados maduros y el control, fueron madurados in vitro en estufa gaseada. Luego de 26 horas de maduración, se evaluó la cantidad de ovocitos lisados, maduros e inmaduros, y se procedió a realizar la técnica ICSI con aquellos que lograron alcanzar el estadio de metafase II utilizando un microscopio invertido Nikon con micromanipuladores y microinyectores. En el dia 7 de cultivo post-ICSI, se clasificó a los ovocitos que tuvieron la capacidad de llegar hasta el estadio de blastocito. Los resultados fueron analizados con el programa de Social Science Statistics, utilizando el test de Chi-Square para destacar las comparaciones. Se observó una disminución significativa en la tasa de clivaje de los ovocitos vitrificados respecto al control sin vitrificar, siendo a su vez inferior la tasa para el grupo de Vitrificaos MII. No se observó una disminución en la tasa de lisis de ovocitos vitrificados inmaduros luego de madurarlos in vitro, ni tampoco se pudo determinar que la maduración se haya visto afectada por el proceso de criopreservación y calentamiento. En conclusión, se pudo determinar que la vitrificación ejerció un efecto negativo sobre los ovocitos, ya que se vio limitada la tasa de división celular una vez fecundados y avanzados en el estadio de maduración. Los resultados además indican que el estadio de MII no sería recomendable para vitrificar ovocitos en las condiciones estudiadas, ya que no fue posible obtener embriones viables.